Обращенно-фазовая хроматография (офх, rp)
Сорбенты
Химически привитые впервые были применены в колоночной жидкостной хроматографии для получения гидрофобных распределительных систем. Поскольку в таких системах происходит «обращение» свойств фаз, т.е. неподвижная фаза становиться неполярной, а подвижная – полярной, то они получили название обращенно-фазовых систем.
Получают ОФ модифицированием поверхностных силанольных групп алкилхлорсиланами. Осуществить модифицирование всех поверхностных силанольных групп не представляется возможным (50%). Вместо монохлорсиланов применяют дихлорсиланы, однако, тогда не все хлорные группы могут прореагировать. Чтобы улучшить степень модифицированности колонки и избавиться от хлор групп колонку обрабатывают сильным силанизирующим агентом - триметилхлорсиланом. При такой обработке удается повысить спепень модификации силикагеля до 90%. Воспроизводимость величины степени покрытия поверхности остается хорошей до тех пор, пока используется одна и та же партия силикагеля. Поэтому ОФ колонки отличаются от партии к партии и от производителя к производителю.
Влияние привитых алкильных групп отражает термин «гидрофобная селективность». В первом приближении коэффициент емкости для данного разделяемого соединения увеличивается с увеличением связанного углерода на единицу объема колонки. Максимальное удерживание обеспечивает привитая октадецильная группа. Такие неподвижные фазы предпочтительны, если растворимость разделяемых веществ в водном элюенте ограничена. С18 характеризуется также высокой селективностью при разделении соседних членов гомологических рядов. В тоже время для разделения соединений, молекулы которых имеют большой размер, высокую гидрофобность и ограниченную растворимость в элюенте с высоким содержанием органических добавок, рекомендуется фаза с короткими привитыми цепями.
Растворители.
Элюотропный ряд обращается, наиболее часто используются растворители ацетонитрил, метанол, тетрагидрофуран, вода.
Коэффициент емкости увеличивается с увеличением содержания воды в элюенте. Выбор растворителя определяется растворимостью в нем вещества. С увеличение содержания органического компонента на 10% К уменьшается в три раза.
Изменить относительное удерживание при элюировании водно-метанольными растворами можно, добавляя в элюент второй органический компонент, например ТГФ. На обращенной фазе сорбируется неполярный компонент элюента и свойства получаемой фазы отличаются от исходной.
Если соединение диссоциирует на ионы, то у пиков на хроматограмме образуются образуются хвосты. Поэтому для лучшей формы пика при анализе кислотных соединений в элюент добавляют не более 1% кислоты, а для основных соединений – триэтиламин или соли.
Влияние структуры на удерживание.
В первом приближении можно принять, что удерживание возрастает с уменьшением растворимости соединения в воде, т.е. с уменьшением полярности. В гомологических рядах прибавление каждой метиленовой группы увеличивает время удерживания. Разветвленные раньше выходят, чем линейные. Насышщенные раньше, чем ненасыщенные
Сравним адсорбционную и ОФ хроматографии.
Равновесие в ОФ устанавливается быстрее, поэтому более приемлемые условия для проведения градиентного элюирования.
Возможность применения водных элюэнтов и анализировать вещества, расворенные в воде.
Срок службы колонок с привитыми фазами гораздо больше, чем у силикагельных колонок.
Многообразие модифицирующих реагентов по сравнению с адсорбционной хроматографией.
Вторичные равновесия на обращенной фазе.
Для разделения диссоциирующих соединений, кроме этого молекула должна быть не очень большой (например как аминокислоты, алкалоиды и т.д.), а соединение, выбранное в качестве противоиона должно обладать длинной насыщенной алкильной цепью (от четырех до десяти атомов углерода в цепочки)
В основу ион-парной хроматографии положены принципы классической экстнракции из водной в органическую фазу ионных веществ в виде ион-парных соединений. В водных элюентах противоионы и ионы разделяемых соединений образуют диссоциирующие ионные пары (в подвижной фазе), которые селективно удерживаются на неподвижной фазе и в результате разделяются. Если противоионы адсорбируются на неподвижной фазе, ионы разделяемых соединений взаимодействуют с ними, удерживаются и соответственно разделяются. Например, соединение, имеющее кислотную группу, будет сорбироваться в виде ионной пары с тетрабутиламмониевым ионом на сорбенте. В результате станет возможным увеличить удерживание анализируемого соединения.
Смотрите также
Этапы определения АК последовательности в пептидах. Синтез белка
Предварительное
освобождение каждого анализируемого пептида от примесей других.
1.
Идентификация NH2- и СООН - концевых остатков.
2.
Расщепление с помощью трипсина неповрежденной цепи ...